一、 运行meerkat

    前面已经依序meerkat 的环境和meerkat，运行了预处理一步，在相对应的bam文件目录下生成了大批文件，因此，当要用meerkat处理某个bam文件时，应先将该bam文件移动到专有的一个文件夹，manual中也建议这样用。

     预处理生成的文件包括：

     黑名单文件.gz

     isinfo文件：包括插入大小信息

     pdf文件：插入大小的分布图，unmapped reads长度的分布图，softclip reads长度分布图

     pre.log文件：日志文件，包括输入的参数，输入输出信息，reads数，unallign reads数等

     softclips.fq.gz： softlip reads文件，完整的read

     softclips.rdist：softclip 的reads长度分布信息记录

     unmapped.fq.gz：unmapped的reads 文件，完整的read

     unmapped.rdist： unmapped的reads长度的分布信息

     sr1.fq.gz : 从softclip read 或者 unmaped read 切下来的指定bp 的reads

     sr2.fq.gz :  与sr1.fq配对的reads

     一个文件夹包括1_1fq.gz，1_2fq.gz ，  里面有不同长度的reads。每个read group 人工的reads 对

   1.1  meerkat.pl

          perl ./scripts/meerkat.pl [options]

         -b  FIle    已经sort过的bam文件

         -k  int    [0/1]是否使用预处理产生的黑名单文件，默认1

         -d  FLT    call discordant mate pairs 的标准差阈值，默认3.这个选项控制怎样寻找discordant read对，等同于定义最大的concordant fragment(配对的reads定位到的片段），计算方法是：中位插入大小+d x sd,如果插入大小分布图狭窄并对称，就使用默认参数，例如下面一二图。如果分布图偏宽，或者带着长尾，三四图，参数应设为5，对于高深度(>30x)，尽管分布图狭窄，但是使用5会轻微好一点。如果峰窄，但是仍然带着一个尾部(图五)，好像大部分TCGA数据那样，在meekat.pl这一步使用5比3更好

         -c  FLT    集簇discordant mate pair标准差阈值，默认和-d相同。控制怎样集簇，构建断点的置信区间。等同于定义覆盖断点的最大片段（中位插入大小+c x sd)。如果-d 选项是5或者小于5，使用用-c相同的参数，如果-d 很大，比如10，那么使用更小的-c，比如5。如果数据有很高的测序深度，或者有广泛的拷贝的变化，那么使用5而不是3来避免不能构建断点的置信区间。

         -p  FLT    call一个事件支持的配对数阈值，默认2

         -o  INT    需要支持全长reads对的数目，默认是0，设定这个选项会降低小复杂事件的敏感度。如果使用-a 1 -l 1推荐使用-o 1 来避免重复序列导致的过多人工产物

         -q  INT    call一个事件支持的split reads数，默认是1

         -z  INT    事件数的最大值，默认1,000,000,000

         -s  INT    从unmapped reads 开始和末端切下来的bp数，必须和与处理的-s 参数设置一样

         -m  INT    [0/1]，如果设定为1，使用meerkat 去去除duplicates，如果设为0，使用Picard 的 flag ‘d‘ marked ，或者其他工具去除duplicates.bwa mem 的数据必须用picard mark duplicate ，所以要设为0.

          -a  INT    [0/1],处理非单一比对，默认1。如果测序质量不好，或者测序深度不够，将参数设为0，这样全部成对的reads都被作为单一比对使用。这依赖bwa mapping 时生成的XT标签。如果没有XT标签，使用选项Q.

          -u  INT    [0/1],使用bam文件的全部比对，如果BAM文件不是由BWA产生的，或者由bwa产生但是没有XT标签，那么开这个选项，开了这个选项会强制关闭-a选项。默认是0。开了这个选项之后应使用-Q 参数过滤低mapping reads,推荐-Q设置10，对于bwa比对过的bam，也可以继续过滤。

          -Q  INT    被使用的reads的最小mapping quality，默认是0

          -g  INT     在主要的bam文件使用的备择mapping数，默认使用全部。备择mapping 数之前通过bwa -N 参数输出到XA标签中。bwa mem 默认 输出备择mapping。

          -f  INT    在clipped 比对中考虑的备择mapping数，默认使用全部。

          -l  INT    [0/1],是否考虑clipped 比对，默认1.和预处理一样，对于bwa mem 出来的基因组，不需要重新mapping.

          -t  INT    在bwa比对中用到的核数，默认1

          -R  STR    包括黑名单read group的文件，每一行一个read group ID

          -F  STR    fasta文件夹路径

          -S  STR    samtools路径，如果samtools不在环境变量中的话

          -W  STR    bwa路径，如果bwa不在环境变量中的话

          -B   STR    blastall 和 formatdb 的路径，如果不在环境变量的话

          -P  STR    指定运行顺序，dc|cl|mpd|alg|srd|rf|all，默认all，每一步运行都需要上一步的结果

                            dc:  extract discordant read pairs，提取discordant read对

                            cl:  construct clusters of discordant read pairs，将discordant read对建簇

                            mpd: call events based on read pairs，基于read 对call 事件

                            alg: align split reads to candidate break point regions，比对split read 到候选的断点区域。如果你有多核心的话，可以将alg步骤切为两步,alg1和alg2，alg1运行多线程，alg2运行单线程。

                            srd:  confirm events based on split reads and filter results，基于split reads和过滤的结果对事件进行证明

                            rf: refine break points by local alignments，通过区域比对定义断点

                            all: run all above steps ,运行全部步骤

           -h    帮助

    manual 中的举例：

    50bp reads，<10x 的TCGA 基因组    使用-s 18 -d 5 -a 0 -l 0 -q 1，猜测：reads 长度较小，所以取1/3 read 长度，-s 取18， TCGA 基因组,插入分布狭窄带尾，所以-d 设为5， 测序深度较低，reads 长度较短，所以尽量保留数据，-a 设为0, -l 设为0，-q 设的较低，1。

    75-101bp reads, 30-40x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 3 -o 1 -a 0 -u 1 -Q 10，猜测：reads长度较长，取1/5read长度，-s 取20，TCGA 基因组,插入分布狭窄带尾，所以-d 设为5，长度较长，深度较深，因此降低敏感度，增加特异度，所以-p 设为3，-o 设为1，由于没有XT tag和XA tag ，因此-a 1 选项无法运行，因此设为-u 1 -a 0 -Q 10 。如果这是bwa mem的数据的话，参数应设为-s 20 -d 5 -p 3 -o 1 -m 0 -l 0，bwa mem 数据不需要重新比对softclips -l 0，必须用picard去除duplicate，-m设为0,估计这个是早版本的bwa，因此比对时可以生成XT标签，-a 默认为1。

    101bp reads, 60-80x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 5 -o 3，75-101bp 使用-s 20，TCGA基因组使用-d 5，测序深度深，-o 设置更高3。

    如果肿瘤基因组60x，相对应的正常基因组30x，那么使用60x的参数，常常用配对的正常组织中的black.list.gz 重命名并放到肿瘤bam文件处理的文件夹，替换cancer的blacklist.gz文件。

     1.2 mechanism.pl

       perl ./scripts/mechanism.pl [options]

        -b  FILE    sort过的bam文件

        -o  INT    [0/1]在TE包括rmsk类型 \"Other\"，默认1

        -t  INT    TE的最大值，默认100000

        -z  INT    被处理的SV的数量限制，默认1000000000

        -R  STR    repeat注释路径，能够从UCSC下载

        -h  help

二、参照

    manual中给出的数据，HapMap个体NA18507（42x深度，100bp读长，500bp插入大小），用10核bwa比对花费1.5天和10GB的内存。30x深度的肿瘤数据，要多于两天并且超过30G的内存，如果测序质量不太好，比如很多的嵌合比对和许多非单一mapped的reads，就会花费更多的时间和内存。、

三、结果

    运行完预处理和meerkat.pl后，能够得到两个文件.intra.refined.typ.sorted和inter.refined.typ.sorted，运行完mechanism.pl后，会得到.variants文件，否则，就该回去看一下设置是否出现问题。

     运行的肿瘤基因组文件的时候，一定要把正常组织的blacklist文件替换肿瘤基因组的blacklist文件，blacklist文件可以在预处理中生成。如果在预处理中出现错误信息“differing read lengths“，没有关系，仅仅是告诉你在一些read group中长度不一致。

 四、包含的其他程序

    4.1 转换variant 文件到vcf格式   

perl ./scripts/meerkat2vcf.pl -i variantfile -o vcffile -H headerfile -F /db/hg18/hg18_fasta/

    -F选项可以产生一个头文件

    4.2  融合基因注释

perl ./scripts/fusions.pl -i variantfile -G /db/hg18/refGene_hg18_sorted.txt

    4.3  为变异位点设计引物

        使用primer.pl

        -i  FILE    输入文件，fusion.pl产生的融合文件

        -o  FILE    输出文件

        -p  STR    引物固定序列

         -c  INT    列数补偿，默认0，如果第一列存在如何事件的样品名称，那么设为1

         -f  INT    侧翼区域，默认500，设计引物所在的区域

         -s  STR    被“，”分隔的引物大小，默认20,23,25,27

         -m  STR    引物最小，最优，最大Tm值，","分隔，默认50，60，65

         -n  INT    对每一个引物片段，设计的音物个数，默认5

          -r  INT    掩盖repeat，默认0

          -q  INT    输出设计引物的侧翼序列

          -F  STR    fasta文件文件夹路径

          -P  STR    primer_core程序文件夹路径

          -L  STR    bla文件夹t路径

          -V  STR    blat服务器，例如fServer start 10.11.240.76 17777/reference/hg18/hg18.2bit -stepSize=5，服务器路径应该为10.11.240.76

          -T  STR    blat端口，上面例子中的17777

          -h  help

    全部音物都是由Primer3生成，对于每一个事件，挑出.1和.2，不同的取向认为是不同的事件，所以取引物的时候直接拷贝出来，不需要额外的反向互补，如果序列是小写字母，那么说明引物在重复序列。理论上，你应该用 1 blat hit 挑出小写的引物。如果blat hit 是0，意味着由太多hit了，所以不要挑选这种引物。有时候，即使引物是在重复序列上（小写字母），但是在基因组上仍然是单一比对的，（1 blat hit)，因为是重复元件的变异，挑选这种引物是可以的。如果由一些引物PCR没有结果，你可以挑选2个正向引物，两个反向引物来同时进行4 个PCR 反应。引物设计的普遍规则仍然要使用，比如，你应该挑选TM 值相差不大并且GC含量不太极端的。

    4.4  计算等位基因频率

        使用discon.pl,这个脚本会告诉你全部断点的discordant 和 concordant的read对.

        -i  FILE    输入variants 文件，必须

       -o  FILE    输入文件，必须

       -D  INT    从bam文件中计算discordant pair的数目，默认0，基因分型的时候打开这个选项

       -B  FILE    bam文件，必须

       -C  FILE    由Meerkat 产生的cluster文件，必须

       -I  FILE    Meerkat 运行时产生的isinfo文件

       -K  FILE    包含要忽略的read group的文件名，一个read ID 一行，和 meerkat.pl的R参数一样

       -S  FILE    samtools文件夹路径，如果samtools不再环境变量中

       -d  FLT    call discordant read 对的标准差阈值，默认3

       -Q  INT    使用的reads 最小的mapping quality，默认0

       -h  help

perl ./scripts/discon.pl -d 5 -Q 10 -i $somaticg -o $somaticg_rp -B $cancer_bam -C
$cancer_cluster -I $cancer_isinfo -K $cancer_blacklistrg -S /home/ly55/opt/samtools/

    结果文件里面每一个事件有一个 RP tag ，A_B_C_D格式

    A：全长的discordant read 对数

    B：从部分比对的reads中discordant的reads数

    C：第一断点的concordant reads 数

    D：第二断点的concordant reads数

    A+B应该等与Meerkat得到的总的reads数

 以上内容仅作个人笔记使用，仅供参考

参考资料

meerkat manual :http://gensoft.pasteur.fr/docs/Meerkat/0.189/Manual_0.189.pdf

生物结构变异分析软件meerkat 0.189使用笔记（二）