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FastQC 测序质量
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FastQC 的使用
FastQC的安装介绍请看这里。FastQC 支持 fastq、gzip 压缩的 fastq、SAM、BAM 等格式，在不指定文件类型的情况下，FastQC 会根据文件的名字来推测文件的类型: 以 .sam 或者 .bam 结尾的文件会被当作 SAM/BAM 文件来打开，并统计 mapped 和 unmapped reads 在内的所有 reads；其它的文件类型则被当作 fastq 格式打开。 其使用语法为：
fastqc [-o output dir] [--(no)extract] [-f fastq|bam|sam] [-c contaminant file] [-t threads] seqfile1 .. seqfileN
-o 用来指定输出文件的目录，需要注意的是，FastQC 不会自动创建新目录，故指定的目录必须存在；
FastQC 输出结果为 .zip 文件，默认参数为 --extract (自动解压缩)，执行时加上 --noextract 则不解压缩；
-f 用来指定输入文件格式，如果不指定则自动检测；
-c 用来指定一个文件，这个文件里面存放可能存在的污染序列，FastQC 会在这个文件里面搜索 reads 中的 overrepresented sequences；
-t 用来指定同时处理的文件个数；
seqfile1 等是需要处理的文件名称；
详细信息请见 fastqc -h 或者 fastqc --help；
我用来分析的命令为 fastqc --noextract -t 2 sample_R1.fq.gz sample_R2.fq.gz -o ./00.FastQC
FastQC 结果解读
上一期我简单地提了一下 FastQC 结果的基本内容，在思考之后，决定把结果中每部分内容给大家仔细解读一下。如图 2 所示：FastQC 的结果包含 12 个方面，其中绿色的结果表示“通过”；黄色的结果表示“警告”；红色的结果表示“不合格”。我们应关注结果中未通过的部分，仔细思考为什么我们的数据会得到这样的结果，可能存在哪些问题？下面我们分别看一下各部分结果的内容，以及 FastQC 判断各部分结果通过、警告和不合格的阈值是什么
1. Basic Statistics
Basic Statistics 的结果给出原始数据的基本信息，包括被分析文件的文件名、文件类型 (actual base calls/colorspace data)、质量值编码方式、序列总数、标记为低质量的序列数、序列长度 和 GC 含量，如图 3 所示：
图 3 Basic Statistics
Basic Statistics 的状态始终都是“通过”，不会出现“警告”或者“不合格”；
这部分结果提供了碱基质量值编码方式，可以记录下来，在后续的分析中会用到。
2. Per Base Sequence Quality
Per Base Sequence Quality 显示 fastq 文件内每一个位置上 (x 轴) 所有碱基的质量值范围 (y 轴)，如图 4 所示：
图 4 Per Base Sequence Quality
图中每一位置都有一个 BoxWhisker 图: 黄色箱子表示 25 - 75 % 的范围，即 IQR (inter-quartile range)，下面和上面的触须分别表示 10 % 和 90 % 的点。蓝线表示均值，红线表示中位数；
碱基的质量值越高越好，背景颜色将图分成三部分：碱基质量很好 (绿色)、碱基质量一般(黄色) 以及碱基质量差 (红色)。
如果任何一个位置的下四分位数小于10或者中位数小于25，会显示“警告”；如果任何一个位置的下四分位数小于5或者中位数小于20，会显示“不合格”。
3. Per Tile Sequence Quality
只有在分析 Illumina 测序结果且保留了序列 ID 信息 (@HWI-D00523:75:C4PY7ANXX:2:1101:1316:2178，见上一讲 fastq 格式介绍) 时才会有这部分结果出现。为了更好的理解这部分的内容，我先简单的介绍一下 flow cell 的构成 (图 5): 图中所示的 flow cell 有八个 lane (lane1 - lnae8)，每个 lane 里面有 3 列 (column1 - column3)，每一列内有100 个 tiles，每个 tile 里面又有 20000 - 30000 个 clusters (不同型号 flow cell 内的 column 数、tile 数及 cluster 数会有一定的差异)。
图 5 flow cell 的构成
Per Tile Sequence Quality 的结果展示每个 tile 在每个碱基位置上偏离这个位置所有 tiles 平均质量值的情况，如图 6 所示：
图 6 Per Tile Sequence Quality
图中横轴代表碱基位置，纵轴代表 tile 编号；
图中的颜色是从冷色调到暖色调的渐变，冷色调表示这个 tile 在这个位置上的质量值高于所有 tile 在这个位置上的平均质量值，暖色调表示这个 tile 的在这个位置上的质量值比其它 tiles 要差；
一个很好的结果，整张图都应该是蓝色；
如果任何 tile 的平均质量值与这个位置上所有 tiles 的平均质量值相差 2 以上会显示“警告”，如果任何 tile 的平均质量值与这个位置上所有 tiles 的平均质量值相差 5 以上会显示“不合格”。
4. Per Sequence Quality Scores
Per Sequence Quality Scores 显示每条序列平均碱基质量的分布，如图 7 所示：
图 7 Per Sequence Quality Scores
图中横轴为测序质量值，纵轴为 reads 数量；
由于成像的原因，得到的测序结果中通常会出现某些 reads 的质量值偏低，这样低质量的 reads 会在图中出现另外一个峰。本图显示的是一个较好的测序结果；
如果最高峰的质量值小于 27 (错误率 0.2 %) 则会显示“警告”，如果最高峰的质量值小于 20 (错误率 1 %) 则会显示“不合格”。
5. Per Base Sequence Content
Per Base Sequence Content 显示每个位置上的碱基组成比例，如图 8 所示：
图 8 Per Base Sequence Content
图中横轴为碱基位置，纵轴为碱基组成比例；
一个完全随机的文库内每个位置上 4 种碱基的比例应该大致相同，因此图中的四条线应该相互平行且接近；
在 reads 开头出现碱基组成偏离往往是我们的建库操作造成的，比如建 GBS 文库时在 reads 开头加了 barcode；barcode 的碱基组成不是均一的，酶切位点的碱基组成是固定不变的，这样会造成明显的碱基组成偏离；
在 reads 结尾出现的碱基组成偏离，往往是测序接头的污染造成的；
如果任何一个位置上的 A 和 T 之间或者 G 和 C 之间的比例相差 10 % 以上则报“警告”，任何一个位置上的 A 和 T 之间或者 G 和 C 之间的比例相差 20 % 以上则报“不合格”。
6. Sequence GC Content
Per Sequence GC Content 显示每条序列平均 GC 含量的分布，如图 9 所示:图 9 Per Sequence GC Content
在一个正常的随机文库中，GC 含量的分布应接近正态分布，且中心的峰值和所测基因组的 GC 含量一致。由于软件并不知道所测物种真实的 GC 含量，图中的理论分布是基于所测数据计算得来的；
如果出现不正常的尖峰分布 (如本图)，则说明文库可能有污染 (如果是接头的污染，那么在 overrepresented sequences 那部分结果还会得到提示)，或者存在其它形式的偏选；
如果偏离理论分布的 reads 数超过总 reads 数的 15 % 则报“警告”，如果偏离理论分布的 reads 数超过总 reads 数的 30 % 则报“不合格”。
7. Per Base N Content
Per Base N Content 显示每个位置上的 N 的比例，如图 10 所示:
图 10 Per Base N Content
在测序仪工作过程中，如果不能正常完成某个碱基的 calling，将会以 N 来表示这个位置的碱基，而不是 A、T、C、G；
有时在序列中会出现较低比例的 Ns，尤其是靠近序列末端的位置，这说明系统不能正常的 call 这部分碱基；
出现一定比例的 Ns 最常见的原因是普遍出现的质量丢失 (a general loss of quality)，这种情况可结合其它部分的结果来综合判断；
另一种常见的现象是文库整体上的测序质量较高，但 reads 开头出现较高比例的 N，这可能是由于文库的碱基组成偏离的比较严重，测序仪不能给出正确的 call，这种情况可以结合 per-base sequence content 的结果来判断；
如果任何一个位置 N 的比例大于 5 % 则报“警告”，大于 20 % 则报“失败”。
8 Sequence Length Distribution
Sequence Length Distribution 的结果显示 reads 长度的分布情况，如图 11 所示：
图 11 Sequence Length Distribution
测序仪出来的原始 reads 通常是均一长度的，但经过质控软件等处理过的数据则不然；
当 reads 长度不一致时报“警告”，当有长度为 0 的 reads 时则报“不合格”。
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